AI 与生物大分子：从一串氨基酸字母到一个能被信任的三维结构

AlphaFold 这类方法做的事可以压成一句话：把一串氨基酸字母，变成一个可以拿去被实验检验的三维结构假设。它值得认真对待，因为它逼着人分清两件常被混为一谈的事：模型吐出的坐标是一个假设，而实验直接测到的是电子密度，原子身份是人赋予的。整篇都围绕这条分界线展开。

一、结构有四个层级，而实验直接测到的只是密度图

蛋白质的结构分四层。一级是残基顺序，二级是主链的局部图案（α 螺旋、β 折叠），三级是整条链折叠成的整体，四级是两条以上已折叠链组成的装配体。同层还有三套词汇：chain 是被建模的一个生物聚合物实例，各带唯一链标识；domain 是链内一段能独立折叠、可能自带功能的区域；entity 是被研究的那个独特分子。RCSB 术语表另定义 biological assembly 为功能上一起起作用的分子组，asymmetric unit 则是精修用的最小晶体片段，未必等于功能装配体。所以「条目里有几条链」和「功能单位有几个亚基」本来就是两个数。

实验结构完全是另一回事。X 射线晶体学测到的是衍射图样，需要每个反射的振幅与相位才能算出电子密度图，而原子坐标是对密度的解读，不是直接测量。官方文档写得很直白：氮和氧的电子数相近，在密度图里几乎长得一样，天冬酰胺这类侧链的身份要靠化学与氢键模式补齐。原子模型还需要额外知识才能建起来，所以官方对 PDB 的总体口径是实验观测与基于知识的建模的混合。PDB-101

模型与证据是否吻合用 R 值检验：完全随机的一堆原子约 0.63，实际典型值约 0.20。精修本身让 R 值偏乐观，所以还要算 R-free，先扣下约 10% 的观测只用其余 90% 精修，再看模型对这 10% 的预测，理想时应与 R 值接近，典型略高约 0.26。分辨率决定密度图能显示多细：约 1 Å 可以轻松看清每个原子，3 Å 或更差只剩蛋白链的基本轮廓，原子结构必须靠推断。

图注：同一段残基侧链在 1.0 Å 到 3.0 Å 四种分辨率下的电子密度图，绿色棒状是拟合出的原子模型。分辨率越低密度越连成团块，原子位置只能靠推断。PDB-101

另外两种方法测到的东西不一样。冷冻电镜拍几千个不同取向的单颗粒，再像做 CT 一样重构出三维密度图，官方举的 β-半乳糖苷酶例子用了九万多张图像。NMR 给的是彼此靠近的原子核与共价键原子的局部构象，形成一份距离约束列表；大蛋白谱峰重叠，官方因此说它限于中小蛋白，但它测溶液中的蛋白，柔性蛋白的首选方法也是它，PDB 中的 NMR 条目通常给出一组都符合约束的 ensemble。

数据底座有多大：RCSB 统计页在 2026 年 11 月 5 日显示已释放结构 262,922 条，其中 X 射线 209,108 条、冷冻电镜 38,137 条、NMR 14,874 条。RCSB统计

PDB 里的结构从一开始就是证据加建模的混合体，连人工解析的结构也不是纯测量。后面读模型输出时，记住这条分界线才不会把预测当事实。

二、每种表示都丢掉一部分信息，选表示就是选任务

讲义用一个玩具蛋白把四种表示的形状摆出来。序列是 6 个残基的 MADKLV，one-hot 编码后是 6×20；多序列比对取 4 条相关序列，是 4×6 的符号网格；成对特征是 6×6×c，c 是通道数；Cα 坐标是 6×3。

每种表示只能回答一类问题：逐残基分类用序列，接触预测用成对矩阵，生成结构用坐标。

坐标有个麻烦，它依赖你选的参考系。真正稳定的量是成对距离

$$D[i,j] = \lVert x[i] - x[j] \rVert_2$$

讲义给的算例很干净。一对点 $(0,0,0)$ 与 $(3,0,0)$，距离 3 Å；整体平移到 $(5,2,1)$ 与 $(8,2,1)$，距离还是 3 Å。旋转同理。只有反射是例外，距离对镜像不变，可镜像结构的手性会反过来。于是得到一对约束：距离对整体旋转平移不变，坐标预测必须等变。把整个分子转一下，一个好的预测模型输出的坐标应该跟着转，形状不变。

成对特征不是凭空来的，它是被构造出来的。接触预测的两段式网络先把序列 profile 与预测的二级结构、溶剂可及性拼成 L×26，送进 1D 残差网络得到 L×n，再转成 L×L×3n 的成对特征，与另外算好的 L×L×3 共变信息合并成 L×L×(3+3n)，最后由 2D 残差网络一次性吐出整张 L×L 接触图。

图注：形状链条：L×26 经 1D 残差网络到 L×n，转成 L×L×3n，与 L×L×3 的共变信息合并，送入 2D 残差网络输出整张 L×L 接触图。图中的共变信息来自 CCMpred 的计算结果，不是网络自己学出来的。接触预测

AF2 把这条线兑现得更彻底。Evoformer 维护 MSA 表示 (s,r,c) 与成对表示 (r,r,c)，两者在每个 block 里互相喂信息。坐标由结构模块产出：每个残基一个刚体帧，旋转部分 (r,3×3) 加平移部分 (r,3)，初始全部堆在原点、朝向一致，更新时先在每个残基自己的局部坐标系里做，再拼回全局。

图注：AF2 结构模块。成对表示、单表示与骨架帧三路进入 IPA 模块，骨架帧初始全部在原点，随后预测相对旋转与平移更新骨架帧，再预测 χ 角算出全部原子位置。AF2

论文明确写，IPA 在每个残基的局部坐标系里生成点做注意力，使结果对整体旋转平移不变；模块在局部系内施加更新，于是整个更新块对残基气体是等变的操作。分子图里还有一条容易踩的坑：序列相邻边在推理时本来就存在，真正的空间相邻边要等结构出来才知道，训练时把后者当输入就是让模型偷看答案。

表示的形状决定你能问什么问题，而距离不变、坐标等变这一对约束，是后面所有架构选择的出发点。

三、MSA 给的是进化共变的统计证据，不是接触的证明

MSA（multiple sequence alignment，多序列比对）是把进化上相关的同源序列按结构对应位置排成的一张矩阵。行是一条序列，列是一个对齐位置。讲义的合成例子有 6 行 6 列：第 1 列全是 M，第 3 列全是 D，第 2、4 列在两组氨基酸之间摇摆，第 5 列一半 L 一半缺口，第 6 列在 V、I 之间摇摆。

先看单列的保守程度，一列的信息量用列熵衡量：

$$H(j) = -\sum_{a} p_j(a) \log_2 p_j(a)$$

全是同一种残基时分布退化成一点，H 为 0 bits；一半 A 一半 G 时，H 为 1 bit。

再看两列之间。讲义给的联合分布是：A 行里 V 出现 3 次、I 出现 0 次，G 行里 V 出现 0 次、I 出现 3 次。若只看边缘分布，第 i 列是一半 A 一半 G，第 j 列是一半 V 一半 I，两列单独看都毫无信息；可把联合分布摆出来，两个位置明显绑在一起。

这就是共变的统计证据：两个位置总是一起变。可它只到这一步。论文对接触的定义是天然结构里两个残基的 Cβ 距离小于 8 Å，共变与接触之间还隔着一层。相关的同源序列也不是独立样本，共享祖先造成的一次变异会在多条序列里重复出现，于是产生伪相关。讲义自己的结论写得准确：依赖不等于接触。

接触预测论文把这一层讲得最清楚。作者把接触之间的高阶相关与成对共变视为互补的两类信息，而不是同一件事的两面，因此「相关等于接触」不能写成结论，接触精度与结构精度也必须分开陈述。接触预测

范式上还发生了一次转变。以前把每个残基对当成独立的二分类问题，现在把整张接触图当成一张图同时预测，这样才能建模长程接触之间的相关。

那 MSA 到底贡献了什么？2026 年 10 月的一篇 arXiv 预印本用因果干预回答了这个问题。拿掉 MSA 之后，局部二级结构大体保留，novel 队列里 84% 的螺旋残基、71% 的片状残基还在，但定义全局拓扑的长程接触只剩 28%，中位 TM-score 从 0.96 掉到 0.52。只要在约四十个残基位置把 MSA 富集的成对表示回填回去，就能恢复中位 71% 的差距，长程接触保留率从 28% 回到 73%。更强的结论是，48 个 block 中第 9 个左右，折叠就已经能从表示里解码出来；模型从比对里读到的是折叠本身的描述，可以跨共享折叠的蛋白迁移。AF3Shortcut

图注：概念示意图。查询序列与 MSA 汇入成对表示后，完整比对时地形是平滑漏斗，无比对时到处是峰。地形是类比，不是真实损失面；路径上的蛋白结构是示意，不是任何具体蛋白的预测结果。AF3Shortcut

这篇是预印本，实验对象限于单链蛋白加 AF3，作者也写明在提供进化信息时前沿模型仍然最好，所以它不能被读成 MSA 没用。MSA 提供的是哪些位置总是一起变这种统计证据，它既不是接触的证明，也解释不了共享祖先带来的假相关。

四、AF1 学几何再搜索，AF2 端到端生成，AF3 用扩散一次成型

三代不是三个并列模型，而是一条能力递进线，每一代只替换掉上一代的一环。

AF1 的四步是：序列与 MSA 特征进深度网络，网络预测整张 L×L 的距离分布（distogram，64 个距离分箱）与扭转角分布，再用它们构造势函数，最后在势上做梯度下降得到坐标。官方补充材料写明总势由距离势、扭转势与平滑项三项组成，权重经交叉验证定为相等；一轮优化是 1,200 步。CASP13 盲测里，43 个自由建模结构域中有 24 个拿到 TM-score 0.7 以上，次优方法是 14 个。

图注：AF1 的五面板官方图。a 是四步流程，b 是网络输出 64 分箱的 L×L 距离分布，c 是一轮 1,200 步梯度下降中 TM score 与 r.m.s.d. 的演化，e 是重复梯度下降次数与最终 TM score 的关系。AF1

这一步正面撞上你点名的第二个卡点：构象空间太大，靠试错搜不完。AF1 的答案是先学分布、再在势上搜索，代价是慢、要多次重启，还可能停在局部极小。

AF2 把这一步删了。Evoformer 让两种表示在每个 block 里互相交换信息，结构模块用刚体帧加 IPA 出全原子坐标。底部那条回收回路是推理期的：上一轮的预测与中间表示被回灌进下一轮，模型参数不变，变的只是状态。

图注：AF2 总览。输入序列经基因库检索得到 MSA、经结构库检索得到模板，汇成 MSA 表示 (s,r,c) 与成对表示 (r,r,c)，进入 Evoformer (48 blocks) 与结构模块 (8 blocks) 产出三维结构；底部浅蓝条是回收回路。图里的 High/Low confidence 只是着色示意，不是 pLDDT 色标。AF2

Evoformer 单个 block 内部有两条路：上面是 MSA 表示走行注意力与列注意力，行注意力带成对偏置；下面是成对表示走三角更新与三角自注意力；两条路之间靠 outer product mean 把 MSA 的信息送进成对表示。

图注：Evoformer 单个 block 的双流结构。成对表示经 pair bias 注入行注意力，MSA 表示经 outer product mean 注入成对表示，成对那一路还有三角更新与三角自注意力。图中的 48 blocks 只指 Evoformer，不含结构模块。AF2

这一步的机制是注意力：查询与键决定谁的信息被组合，值提供被组合的内容。

$$\text{Attention}(Q,K,V) = \text{softmax}\left(\frac{QK^\top}{\sqrt{d}}\right) V$$

讲义的玩具算例是三个值各带 0.1、0.7、0.2 的权重，输出就是 $0.1 v_1 + 0.7 v_2 + 0.2 v_3$，权重和为 1。可以把注意力想成一层层筛选：查询与键比对之后，只有匹配上的位置的信息被取出来加权汇总。权重高说明两个位置在当前上下文里关系密切，但关系密切不等于空间接触。

AF3 换掉了两处。第一处是 Evoformer 换成更简单的 Pairformer，MSA 处理被大幅弱化，之后不再保留 MSA 表示，所有信息只经由成对表示传递，而成对处理与 block 数相对 AF2 基本不变。第二处是结构模块换成扩散模块，直接在原始原子坐标上去噪，取代基于残基刚体帧与侧链扭转角的输出方式。

图注：AF3 推理架构。输入经模板模块与 MSA 模块后进入 Pairformer (48 blocks)，再由扩散模块与置信度模块输出原子坐标；底部两条虚线回路分别是 Recycling 与 Diffusion iterations，是两种不同的循环。AF3

图注：AF3 扩散模块内部。一团随机点云先经随机旋转平移，再依次通过原子级局部注意力、token 级全局注意力、原子级局部注意力，右侧输出有序的原子球。AF3

扩散模块的训练任务是给被加噪的坐标、让它还原真实坐标。最小算例讲义里有：$x_{ref} = 2.0$、$\sigma = 0.5$、$\varepsilon = -1.0$，则 $x_{noisy} = 2.0 + 0.5 \times (-1.0) = 1.5$。推理时从随机噪声出发反复去噪，逐步长出一个结构。

这里有一个反直觉但重要的官方说法：AF3 的架构明确不需要对分子的整体旋转平移做等变或不变处理，因此直接省略了。第二节那条等变约束不是物理定律，而是可以被设计选择兑现或放弃的工程决定。收成一句话：AF1 要搜，AF2 端到端，AF3 用扩散一次成型；每换一代，评价它的尺子也要换。

五、高置信只说明模型自己有把握，不等于结构合法，更不等于功能成立

模型给出坐标时会同时给出置信度。读置信度要分层，每一层回答不同的问题。

第一层是局部。pLDDT（predicted lDDT）是 0 到 100 的逐残基局部置信度，只看这一段局部距离对不对，不看整体摆放。官方用词分四档。

图注:pLDDT 局部置信度官方四档阈值

第二层是相对摆位。PAE（predicted aligned error）的官方定义是：若在残基 Y 上对齐，残基 X 的期望位置误差，单位是埃。它是非对称的。读图时先找链边界虚线，再看跨域区块的颜色深浅，深绿表示这一对区域的相对摆位可信；对角线永远是深绿，因为那相当于自己和自己对齐，没有信息量。

图注：PAE 矩阵。横纵轴是残基序号，侧边色条标出 A、C、D、F 四条链，虚线黑框是链边界，右侧色标为 0 到 30 Å 的期望位置误差。跨链区块深绿说明这些区域之间的相对摆位可信。AF3

第三层是界面。DockQ 衡量复合物界面与参考结构的一致程度。官方材料给出的实用阈值是，ipTM 高于 0.8 可信，0.6 到 0.8 不确定，低于 0.6 可能有问题；pDockQ2 约 0.23 以上可以当参考。EMBL-EBI

第四层是几何合法性，这一层不能省。AF3 的官方论文自己承认模型输出不总尊重手性，PoseBusters 上的手性违规率是 4.4%，原子碰撞会减少但消不掉，无序区还会出现幻觉。更直接的数字来自一篇 2026 年 10 月的 arXiv 预印本：在 CASP15 上，AF3 有 26% 的靶标，五个采样里没有一个是物理合法的。

图注：CASP15 上四个 AF3 家族模型的物理合法率，AlphaFold 3 为 0.740，Protenix 0.650，Boltz-2 0.697，OpenFold3 0.818。纵轴是每个靶标五个样本里至少有一个物理合法样本的靶标比例。推理期投影

这篇预印本给出的补救办法也很有意思：它在推理期对去噪器输出的干净坐标施加两个闭式投影算子，一个处理链间立体冲突，一个处理配体内部几何（键长键角、芳环共面、手性翻转），位移上限 0.45 Å，不改权重、不需要梯度。在五个基准上合法率提到 1.000 而精度一列不动，运行时开销在 3.5% 以内。底座是 Boltz-2 与 OpenFold-3，不是 AF3 本身。推理期投影

第五层是功能，只能靠实验。讲义把最强可支持的断言排成阶梯：高局部置信度只支持「局部看起来可信的模型」，预测界面只支持「一个候选的相互作用几何」，实测结合只支持「在测试条件下发生了结合」，每往上一级都要新的证据。收口用官方那句话：置信度反映的是模型对自己三维排列的把握，不是对生物学正确性的把握。AFDB

六、把问题反过来问就是设计，而设计的答案必须回到实验

蛋白语言模型走的是另一条路：自监督预训练。目标函数写在讲义里，M 是被遮住的位置集合：

$$\mathcal{L} = -\sum_{i \in \mathcal{M}} \log p_\theta(s_i \mid \text{visible sequence})$$

玩具例子是 MADKLV 遮住第三个位置，模型只能靠上下文猜出 D。ESMFold 把这条路接到了结构上：输入只有一条序列，先过经掩码语言模型预训练的 ESM-2，再过 48 个 folding block 的 folding trunk 与 8 个 block 的结构模块，输出结构与置信度。

图注：ESMFold 架构。单条序列进入经掩码语言模型预训练的 ESM-2，再经过 48 个 folding block 的 Folding Trunk 与 8 blocks 的 Structure Module，输出预测结构与置信度，右侧是 folding block 内部放大。图里没有 MSA 检索分支。ESMFold

图注：结构信息随模型规模涌现。长程接触精度 P@L 随同源命中数与模型参数量上升，8M 到 15B 规模逐级给出接触精度散点，右侧是不同规模下的结构叠合与 pLDDT 着色。纵轴是接触精度，不是 TM-score。ESMFold

必须点明一件事：免掉的是推理期的目标特异 MSA，不是进化信息本身。ESM-2 在 UniRef 的约 4310 万个 UniRef50 簇与约 1.38 亿条 UniRef90 序列上预训练，进化信息被吸收进了参数，推理时不再需要外部数据库检索。公平比较的口径是整条流水线：ESMFold 在 CAMEO 上平均 TM-score 0.83、CASP14 上 0.68，用完整 MSA 与模板的 AlphaFold2 分别是 0.88 与 0.85。ESMFold

把问题反过来问，答案就不再唯一。逆折叠是给骨架求序列：ProteinMPNN 只用原子间距离（N、Cα、C、O 与虚拟 Cβ）编码骨架，解码器按随机顺序逐位输出概率，采样得到的序列再回灌给下一轮。讲义的玩具概率表给了一个位置的分布，K 占 0.6、R 占 0.3、A 占 0.1。

图注：ProteinMPNN 架构。骨架坐标转成 N、Cα、C、O 与虚拟 Cβ 的距离后进入 Backbone Encoder，解码器按随机解码顺序逐位输出概率，采样得到序列再回灌节点特征。输出的是一串概率，不是一个答案。ProteinMPNN

同一个骨架兼容大量序列，官方评测里 native sequence recovery 只有 52.4%，Rosetta 是 32.9%。这不是缺陷，而是问题本身的性质，一个骨架对应一族序列。你在预测方向上问的同一条序列可能对应多种形状，在设计方向上就变成一个骨架对应多种序列，非唯一性换了个方向出现。论文自己的收尾是，最终检验必须靠实验。ProteinMPNN

从头设计再往前走一步，连骨架也不给定。RFdiffusion 把 RoseTTAFold 结构预测网络用结构去噪任务微调成扩散生成器，条件化入口有四种，无条件生成、指定对称性、给定结合靶点的界面热点、支架化功能 motif。

图注：蛋白设计与扩散。a 面板上半是前向加噪与反向去噪链，中部把 RoseTTAFold 与 RFdiffusion 的输入输出并排对比，下部是单步更新与 self-conditioning 回路。b 面板列出四类条件化任务，c 面板是 300 残基链的设计轨迹，图中没有任何成功率数字。RFdiffusion

官方对 in silico 成功的判据很严：把设计的序列交给 AF2 预测，预测对齐误差 pAE 小于 5，整体骨架 r.m.s.d. 小于 2 Å，功能位点处 r.m.s.d. 小于 1 Å。而实验成功率要低得多：5 个靶点每个挑 95 个设计进入实验，用 10 μM 单点结合测定的总体成功率是 19%。生成的候选不等于功能的证据，这是这一行最该记住的数字。RFdiffusion

设计因此是一个多目标问题，四项分别需要不同证据。

最后给一张速查表，只列名词与结论。

回到开头那句话：一串氨基酸字母变成一个能被信任的三维结构，靠的是三条纪律。共变是统计证据，不是接触的证明；置信度反映模型自己的把握，不是生物学正确性；模型自评与实验是两层证据，不能互相顶替。三条都守住，AlphaFold 这类工具才算真的会用。

参考文献

本专题引用的核心资料如下，建议深入学习时阅读原文：

1. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold（AlphaFold 2） — Nature 596:583–589
2. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3 — Nature 630:493–500
3. Improved protein structure prediction using potentials from deep learning（AlphaFold 1） — Nature 577:706–710
4. Evolutionary-scale prediction of atomic-level protein structure with a language model（ESMFold） — Science 379:1123–1130
5. Accurate De Novo Prediction of Protein Contact Map by Ultra-Deep Learning Model — PLoS Comput Biol 13(1):e1005324
6. Robust deep learning–based protein sequence design using ProteinMPNN — Science 378:49–56
7. De novo design of protein structure and function with RFdiffusion — Nature 620:1089–1100
8. A Shortcut to Structure in AlphaFold 3（arXiv 预印本，未经同行评审） — arXiv:2610.08937
9. RCSB PDB-101 官方指南与 RCSB PDB 结构统计（官方文档，数据抓取日 2026-11-05） — pdb101.rcsb.org
10. Inference-Time Projection for Physically Valid Biomolecular Diffusion Models（arXiv 预印本，未经同行评审） — arXiv:2610.07037

版本与口径说明：AlphaFold 1 论文正文受付费墙限制，本文的流程与数字取自官方摘要、图注与补充材料方程；ESMFold 与 ProteinMPNN 的 Science 正刊正文在本环境无法打开，机制与数字取自同文的 bioRxiv 预印本（分别为 v3 与 v1）；第 8、10 条为 2026 年 10 月的 arXiv 预印本，结论限于各自实验口径，第 8 条只覆盖单链蛋白与 AlphaFold 3，第 10 条的底座是 Boltz-2 与 OpenFold-3 而非 AlphaFold 3 本身；第 9 条的官方统计是活页数据，只在 2026-11-05 成立，讲义第 58 页的 2025 年 12 月快照已过时，本文以官方当前值为准。